ВИДІЛЕННЯ БІЛКІВ
Виділення практично чистого індивідуального білка (в таких випадках часто використовують не цілком вдалий термін "гомогенний білок") - необхідна передумова для вивчення його будови і функціональних властивостей. Технічні прийоми, використовувані для цього, дуже різноманітні і швидко удосконалюються, причому поряд з розвитком мікрометодів все частіше виникає необхідність масштабування процесів, з тим, щоб отримувати великі кількості високоочищених білків для потреб медицини та біотехнології. Особливо загострилася потреба в ефективних методах розділення білків з розвитком генно-інженерних способів їх отримання. У цьому розділі розглянуто лише найбільш загальні принципи препаративної хімії білків.
Особливості виділення білків
Отримання чистих хімічних індивідуальних білків включає в себе як видалення небілкових домішок, так і поділ між собою власне білкових компонентів. Остання частина завдання в силу подібності фізико-хімічних властивостей білків особливо складна, тому саме її рішення визначає вибір тих чи інших схем виділення білка. При цьому необхідно враховувати деякі особливості поведінки, властиві всім білків.
До них відноситься, перш за все, здатність білків піддаватися денатурації, тобто зазнавати такі зміни просторової будови, які призводять до втрати або часткової втрати функціональних властивостей. Правда, денатурація в багатьох випадках оборотна, однак ця оборотність не забезпечується автоматично, а вимагає в кожному окремому випадку підбору спеціальних прийомів. У той же час повністю або навіть частково денатуровані білки дуже вразливі для незворотних ушкоджень, особливо для дії протеолітичних ферментів, тому умов, що сприяють денатурації, слід всіляко уникати.
Для запобігання теплової денатурації виділення білка проводять при низькій температурі, зазвичай при 4 ° С. Необхідно також уникати крайніх значень pH. Білки легко денатурують при низьких рН через протонування негативно заряджених в нормальних умовах карбоксильних груп і виникає внаслідок цього різкого переважання позитивних зарядів, яке сприяє розгортанню компактної структури. У лужному середовищі при рН 10 і вище втрачаються позитивні заряди, обумовлені протонуванням е-аминогрупп лізину, і знову-таки настає декомпенсація зарядів на поверхні, що дестабілізує глобулу. Одночасно фенольні гідроксили тих залишків тирозину, які були приховані всередині глобули, отримавши негативний заряд, прагнуть вийти на поверхню, що також сприяє денатурації білка.
У ще більш лужних розчинах відбуваються реакції, необоротно ушкоджують білок, - відщеплення сірки від залишків цистеїну і цистину, в-елімінування фосфатних залишків в Фосфопротеіни, відщеплення полісахаридних ланцюгів, приєднаних до залишків серину в глікопротеїну. Утворені в результаті цих реакцій залишки неграничних амінокислоти - дегідроаланіна - приєднуються до прилеглих е-аминогруппам лізину з утворенням так званого лізіноаланіна - з'єднання, присутність якого в кислотному гід-ролізате білка свідчить про глибоку пошкодженні його структури.
Причиною денатурації може стати застосування органічних розчинників, здатних порушити істотну для стабільності білка систему гідрофобних контактів усередині глобули. Треба також враховувати можливість денатурації білка на межі поділу фаз, Особливо при утворенні піни. При виділенні дуже малих кількостей білка, що не рідкісному в сучасній біохімії, слід рахуватися з втратами, викликаними його адсорбцією, часто незворотною, на поверхні скла або полімерних матеріалів, особливо значною на заключних стадіях очищення.
Особливу небезпеку при виділенні білків представляють містяться в вихідному матеріалі протеолітичніферменти, навіть якщо вони присутні в невеликій кількості. Пошкодження, яке призводить до утворення помилкових множинних форм білка, а іноді і його глибоке розщеплення стають особливо ймовірними, якщо схема виділення включає умови, які наближають білок до денатурації. Для запобігання протеолізу необхідно вже на ранніх стадіях очищення включати операції, спрямовані на відділення протеїназ, додавати до суміші інгібітори різних класів протеїназ. Дуже важливо проводити очистку білка швидко, що знижує небезпеку протеолізу і ймовірність денатурації.
Поширена думка про особливу нестабільності чистих білків. Дійсно, що містяться в неочищених препаратах сторонні білки в певній мірі захищають білок від денатуруючих впливів та протеолізу. На проміжних стадіях, коли повна
очищення ще не досягнута, небезпека протеолізу збільшується, з видаленням же слідів протеїназ на завершальних етапах очистки стабільність білка повинна знову зрости. Втім, зростає і небезпека сорбційних втрат на поверхнях, які можуть сприйматися експериментатором як притаманна чистому білку нестабільність.
Характерні властивості білків, на яких грунтується їх поділ
На яких фізико-хімічні особливості білків можуть бути засновані способи їх поділу? По-перше, це розмір молекули, її геометрія. На використанні цієї особливості базуються методи гель-хроматографії і ультрафільтрації, почасти електрофорез в гелях.
По-друге, характерне для даного білка розподіл заряджених груп на його поверхні. Співвідношення катіонних і аніонних груп в білку змінюється в залежності від рН, ізоелектричної точки білків - pI (значення рН, при якому позитивні і негативні заряди білка повністю компенсовані і сумарний заряд дорівнює нулю) істотно розрізняються у різних білків. Відомі білки, які є в фізіологічних умовах катіонними, аніонними або молекулами без помітного переважання того чи іншого заряду. На відмінності заряду білків при різних рН грунтується їх поділ методами електрофорезу, ізоелектричного фокусування, ізоелектричної і іонообмінної хроматографії. Істотно, проте, не тільки співвідношення заряджених груп, визначальне значення pI. Білки з подібними Ізоелектрична точками можуть відрізнятися розподілом заряджених функціональних груп по поверхні глобули. Останні розміщуються більш-менш рівномірно або; навпаки, утворюють локальні згущення, грона однаково заряджених груп, що позначається при ионнообменной хроматографії білка.
По-третє, білки розрізняються числом і характером гідрофобних ділянок поверхні, що використовують при гидрофобной хроматографії
Зауважимо, що жоден з розглянутих вище ознак не може сам по собі забезпечити виділення індивідуального білка зі складної суміші - вони недостатньо типова, не гарантують вибірковості очищення. Значно більш перспективно в цьому відношенні
використання для виділення функціональних властивостей білка. Дійсно, серед безлічі білків у вихідному матеріалі знайдеться чимало таких, які мають подібну молекулярну масу або близькі ізоелектричної точки, однак число, наприклад, фосфатаз або амілаз буде свідомо невеликим. Очевидно, що метод виділення, заснований на використанні здатності цих ферментів взаємодіяти зі своїм специфічним субстратом, незрівнянно виборчі, ніж будь-який прийом, який базується на різниці фізико-хімічних властивостей.
Схеми виділення білків, що використовують тільки один який-небудь принцип, рідкісні, зазвичай різні підходи до фракціонування поєднуються і доповнюють один одного.
Поділ білків за молекулярною масою. Гель-хроматографія (гель-фільтрація)
У цьому методі використовують гранульовані гелі поперечно-зшитих гідрофільних матеріалів, наприклад декстрану (сефадексе, сефароза і їх аналоги), поліакриламіду (біогелі і їх аналоги), полівінілового спирту (тойоперл). Гранули утворені тривимірної сіткою полімеру, яка непроникна для великих молекул, частково проникна для молекул проміжного розміру і добре проникна для невеликих молекул, солей і води. Залежно від середнього розміру осередку полімерного гелю і геометрії молекули останньої доступна більша або менша частина загального обсягу гранул гелю.
При русі розчину, що містить білки та інші молекули, по колонці, яка заповнена набряклими гранулами гелю, компоненти суміші, які проникли в гель, затримуються в ньому. Таким чином, вони відстають від більш великих молекул, які не можуть увійти всередину гранул і знаходяться тільки в омиває їх розчині. Не будучи включеними в гель, великі молекули з'являються в елюаті, як тільки через колонку пройде "вільний" обсяг розчину, що дорівнює об'єму розчину, укладеним між гранулами гелю. Останній визначається щільністю упаковки і геометрією гранул. Сферичний, у вигляді яких зазвичай і випускаються матеріали для гель-хроматографії, вільний обсяг становить 30-35% загального обсягу колонки.
Якщо розміри молекул білка такі, що вони можуть проникати в пори, складові певну частину обсягу гранул, то буде спостерігатися затримка елюціі і білок з'явиться в обсязі Ve, пов'язаному з коефіцієнтом доступності (процентним відношенням обсягів гранул, доступною даному виду молекул) співвідношенням:
де V, - повний обсяг колонки, за вирахуванням тієї його частини, яка припадає на сам гель утворює полімер.
Кожному білку в залежності від розмірів його молекули відповідає своє значення, на чому і заснувало поділ при гель-хроматографії. Зрозуміло, що якщо обсяг елюціі близький до вільного об'єму, то прагне до нуля і поділу білків, молекули яких практично не входять в пори гелю, не відбудеться. Точно так же молекули невеликих розмірів, для яких проникний весь обсяг гелю (Ve близький до і прагне до одиниці), в гелі з даними характеристиками розділяться. Найкраще дозвіл виходить, якщо знаходиться в межах 0,4 - 0,6. Зрозуміло, межі поділу можна розширити, використовуючи для високомолекулярних білків великопористі, а для невеликих - дрібнопористі гелі.
Строго кажучи, при гель-хроматографії поділ білків визначається не молекулярної масою, а геометричними розмірами молекули. Відповідно, молекули витягнутої форми за рахунок "перекидання" в розчині важче проникають в гелі, ніж сферичні молекули такий же молекулярної маси. Цим пояснюється рання елюція денатурованих білків, які ведуть себе як невпорядкований пухкий клубок, а не як компактна кулька.
Проста залежність між обсягом елюціі і молекулярною масою білка (справедлива, звичайно, тільки для компактних сферичних молекул) і легкість експерименту зробили гель-хроматографію улюбленим методом визначення молекулярної маси білків. Для цієї мети колонку, заповнену відповідним гелем, калібрують набором білків з відомими молекулярними масами, після чого визначають обсяг елюціі досліджуваного білка і обчислюють його молекулярну масу інтерполяцією. Точність методу не дуже велика, але цілком достатня для більшості практично можна зустріти завдань.
При використанні даного методу необхідно враховувати обмеження, що виникають із-за того, що гель, який утворює матеріал не цілком інертний, як це передбачає теорія методу, і може взаємодіяти з речовинами, що, що спотворює залежність обсягу елюціі від розміру молекули. Це особливо позначається при поділі малих кількостей білка, так як сорбційна ємність матриці гелю невелика і в великомасштабних дослідах її взаємодія з білком мало відбивається на процесі.
Зв'язування білків гельобразующімі матеріалами може бути викликано іонообмінними взаємодіями, зокрема вмістом негативно заряджених груп в полісахаридних матрицях (сефароза, сефадексе), а також в поліакриламідних матеріалах. В останніх карбоксильні групи виникають при спонтанному гідролізі амідів, в полисахаридах ж вони можуть утворюватися в результаті окислення. Затримка при гель-хроматографії, викликана іонообмінними взаємодіями з матрицею, особливо характерна для катіонних білків, наприклад лізоциму і деяких субтилизина. Нерідко вона дуже значна і може навіть перешкоджати відділенню солей від білка. В аналітичних дослідах таке утримування вдається придушити значним підвищенням іонної сили розчину.
Ще одна причина аномального утримування речовин при гель-хроматографії, особливо помітна при виділенні невеликих молекул, наприклад пептидів. - Гидрофобное зв'язування з матрицею гелю.
Гідрофобні елементи включаються в гідрофільні полісахаридні матриці при обробці їх зшиваючими агентами, зокрема епі-хлоргидрина, при синтезі сефадексе. Пептиди, що містять гідрофобні, особливо ароматичні, залишки (фенілалаііна, триптофану) іноді утримуються матрицею настільки значно, що з'являються в елюаті пізніше неорганічних солей.
Роздільна здатність методу не дуже велика, в той же час простота проведення і м'якість умов експерименту є його безперечними перевагами. Застосування методу на перших етапах очистки обмежується тим, що для задовільного фракціонування білків обсяг наноситься розчину не повинен перевищувати
3-5% загального обсягу колонки. Зважаючи на це до гель-хроматографії зазвичай вдаються в середині або на завершальних етапах виділення білка. Зрозуміло, при відділенні низькомолекулярних домішок, зокрема при обессоливании, обсяг зразка може бути значно більшим, оскільки не потрібно високої роздільної здатності. В такому спрощеному варіанті гель-фільтрацію використовують особливо часто.
Незважаючи на зазначені обмеження, гель-хроматографія - зручний спосіб фракціонування білків. Його застосовують і для відділення від білків низькомолекулярних домішок, в тому числі солей.
Останнім часом поряд з гельобразующімі матеріалами для розділення білків за розмірами почали застосовувати макропористі неорганічні носії - макропористі скло і силікагель. Зазвичай поверхню цих матеріалів покривають гідрофільними органічними речовинами, щоб виключити необоротну сорбцію білків. Жорсткість цих матеріалів дозволяє розділяти білки за розміром молекул при підвищеному тиску, що прискорює процес і знижує перешкоди з боку дифузії.
Ионообменная хроматографія білків
Метод іонообмінної хроматографії, заснований на відмінностях в співвідношенні і розподілі заряджених груп на поверхні білка, належить до числа найбільш використовуваних. У хроматографії білків практично не застосовують синтетичні іонообмінні смоли на основі полістиролу, вельми популярні в аналітичній хімії амінокислот і пептидів. Це пояснюється, по-перше, великим вмістом поперечних зшивок, які роблять матеріали такого роду практично непроникними для білків, по-друге, сорбцией білків, часом необоротною, на гідрофобною поверхні полістиролу.
За вказаними міркувань для поділу білків використовують ионообменники, в яких матриця ( "підкладка") чітко гідрофільна. Особливо поширені ионообменники, одержувані приєднанням монотонних груп до целюлози, поперечно-зшитих декстранами (сефадексе).
Для отримання катіонів як ионогенной найчастіше використовують карбоксильну групу рКа якої, кілька змінюється в залежності від мікрооточення, близький до 4 (карбоксиметил (СМ) -проізводние целюлози, сефадексе, що містять угруповання
Карбоксильні групи таких іонітів негативно заряджені при рН 5 і вище і, отже, здатні зв'язувати білки, які в цих умовах несуть позитивний заряд. Зв'язування білків посилюється, якщо на їх поверхні зустрічаються скупчення ( "грона") катіонних груп. За інших рівних умов з катионитом краще зв'язуються білки більшою молекулярної маси, що пояснюється кооперативністю многоточечного взаємодії великих ділянок поверхні такого білка з аніонними групами іонообмінника.
Десорбція білків, пов'язаних катионитом, зазвичай досягається підвищенням іонної сили елюіруются розчину, причому взаємодіючі між собою заряджені групи білка і ионита виявляються в оточенні протилежно заряджених іонів солей. В результаті при певній концентрації солі, характерною для кожного білка, електростатичні взаємодії між ним і іонітом знімаються і білок елюіруются з колонки. Плавне збільшення іонної сили розчину, застосування лінійного або більш складного градієнта концентрації солі викликає десорбції спочатку найбільш слабо утримуваних молекул, потім більш міцно пов'язаних білків і т.д. У препаративних дослідах нерідко вдаються до ступінчастою елюції, при якій концентрації солі підвищується стрибками. Це прискорює поділ і дозволяє зібрати білок в невеликому обсязі, проте легко призводить до утворення одним і тим же білком кількох помилкових.
Виділення практично чистого індивідуального білка (в таких випадках часто використовують не цілком вдалий термін "гомогенний білок") - необхідна передумова для вивчення його будови і функціональних властивостей. Технічні прийоми, використовувані для цього, дуже різноманітні і швидко удосконалюються, причому поряд з розвитком мікрометодів все частіше виникає необхідність масштабування процесів, з тим, щоб отримувати великі кількості високоочищених білків для потреб медицини та біотехнології. Особливо загострилася потреба в ефективних методах розділення білків з розвитком генно-інженерних способів їх отримання. У цьому розділі розглянуто лише найбільш загальні принципи препаративної хімії білків.
Особливості виділення білків
Отримання чистих хімічних індивідуальних білків включає в себе як видалення небілкових домішок, так і поділ між собою власне білкових компонентів. Остання частина завдання в силу подібності фізико-хімічних властивостей білків особливо складна, тому саме її рішення визначає вибір тих чи інших схем виділення білка. При цьому необхідно враховувати деякі особливості поведінки, властиві всім білків.
До них відноситься, перш за все, здатність білків піддаватися денатурації, тобто зазнавати такі зміни просторової будови, які призводять до втрати або часткової втрати функціональних властивостей. Правда, денатурація в багатьох випадках оборотна, однак ця оборотність не забезпечується автоматично, а вимагає в кожному окремому випадку підбору спеціальних прийомів. У той же час повністю або навіть частково денатуровані білки дуже вразливі для незворотних ушкоджень, особливо для дії протеолітичних ферментів, тому умов, що сприяють денатурації, слід всіляко уникати.
Для запобігання теплової денатурації виділення білка проводять при низькій температурі, зазвичай при 4 ° С. Необхідно також уникати крайніх значень pH. Білки легко денатурують при низьких рН через протонування негативно заряджених в нормальних умовах карбоксильних груп і виникає внаслідок цього різкого переважання позитивних зарядів, яке сприяє розгортанню компактної структури. У лужному середовищі при рН 10 і вище втрачаються позитивні заряди, обумовлені протонуванням е-аминогрупп лізину, і знову-таки настає декомпенсація зарядів на поверхні, що дестабілізує глобулу. Одночасно фенольні гідроксили тих залишків тирозину, які були приховані всередині глобули, отримавши негативний заряд, прагнуть вийти на поверхню, що також сприяє денатурації білка.
У ще більш лужних розчинах відбуваються реакції, необоротно ушкоджують білок, - відщеплення сірки від залишків цистеїну і цистину, в-елімінування фосфатних залишків в Фосфопротеіни, відщеплення полісахаридних ланцюгів, приєднаних до залишків серину в глікопротеїну. Утворені в результаті цих реакцій залишки неграничних амінокислоти - дегідроаланіна - приєднуються до прилеглих е-аминогруппам лізину з утворенням так званого лізіноаланіна - з'єднання, присутність якого в кислотному гід-ролізате білка свідчить про глибоку пошкодженні його структури.
Причиною денатурації може стати застосування органічних розчинників, здатних порушити істотну для стабільності білка систему гідрофобних контактів усередині глобули. Треба також враховувати можливість денатурації білка на межі поділу фаз, Особливо при утворенні піни. При виділенні дуже малих кількостей білка, що не рідкісному в сучасній біохімії, слід рахуватися з втратами, викликаними його адсорбцією, часто незворотною, на поверхні скла або полімерних матеріалів, особливо значною на заключних стадіях очищення.
Особливу небезпеку при виділенні білків представляють містяться в вихідному матеріалі протеолітичніферменти, навіть якщо вони присутні в невеликій кількості. Пошкодження, яке призводить до утворення помилкових множинних форм білка, а іноді і його глибоке розщеплення стають особливо ймовірними, якщо схема виділення включає умови, які наближають білок до денатурації. Для запобігання протеолізу необхідно вже на ранніх стадіях очищення включати операції, спрямовані на відділення протеїназ, додавати до суміші інгібітори різних класів протеїназ. Дуже важливо проводити очистку білка швидко, що знижує небезпеку протеолізу і ймовірність денатурації.
Поширена думка про особливу нестабільності чистих білків. Дійсно, що містяться в неочищених препаратах сторонні білки в певній мірі захищають білок від денатуруючих впливів та протеолізу. На проміжних стадіях, коли повна
очищення ще не досягнута, небезпека протеолізу збільшується, з видаленням же слідів протеїназ на завершальних етапах очистки стабільність білка повинна знову зрости. Втім, зростає і небезпека сорбційних втрат на поверхнях, які можуть сприйматися експериментатором як притаманна чистому білку нестабільність.
Характерні властивості білків, на яких грунтується їх поділ
На яких фізико-хімічні особливості білків можуть бути засновані способи їх поділу? По-перше, це розмір молекули, її геометрія. На використанні цієї особливості базуються методи гель-хроматографії і ультрафільтрації, почасти електрофорез в гелях.
По-друге, характерне для даного білка розподіл заряджених груп на його поверхні. Співвідношення катіонних і аніонних груп в білку змінюється в залежності від рН, ізоелектричної точки білків - pI (значення рН, при якому позитивні і негативні заряди білка повністю компенсовані і сумарний заряд дорівнює нулю) істотно розрізняються у різних білків. Відомі білки, які є в фізіологічних умовах катіонними, аніонними або молекулами без помітного переважання того чи іншого заряду. На відмінності заряду білків при різних рН грунтується їх поділ методами електрофорезу, ізоелектричного фокусування, ізоелектричної і іонообмінної хроматографії. Істотно, проте, не тільки співвідношення заряджених груп, визначальне значення pI. Білки з подібними Ізоелектрична точками можуть відрізнятися розподілом заряджених функціональних груп по поверхні глобули. Останні розміщуються більш-менш рівномірно або; навпаки, утворюють локальні згущення, грона однаково заряджених груп, що позначається при ионнообменной хроматографії білка.
По-третє, білки розрізняються числом і характером гідрофобних ділянок поверхні, що використовують при гидрофобной хроматографії
Зауважимо, що жоден з розглянутих вище ознак не може сам по собі забезпечити виділення індивідуального білка зі складної суміші - вони недостатньо типова, не гарантують вибірковості очищення. Значно більш перспективно в цьому відношенні
використання для виділення функціональних властивостей білка. Дійсно, серед безлічі білків у вихідному матеріалі знайдеться чимало таких, які мають подібну молекулярну масу або близькі ізоелектричної точки, однак число, наприклад, фосфатаз або амілаз буде свідомо невеликим. Очевидно, що метод виділення, заснований на використанні здатності цих ферментів взаємодіяти зі своїм специфічним субстратом, незрівнянно виборчі, ніж будь-який прийом, який базується на різниці фізико-хімічних властивостей.
Схеми виділення білків, що використовують тільки один який-небудь принцип, рідкісні, зазвичай різні підходи до фракціонування поєднуються і доповнюють один одного.
Поділ білків за молекулярною масою. Гель-хроматографія (гель-фільтрація)
У цьому методі використовують гранульовані гелі поперечно-зшитих гідрофільних матеріалів, наприклад декстрану (сефадексе, сефароза і їх аналоги), поліакриламіду (біогелі і їх аналоги), полівінілового спирту (тойоперл). Гранули утворені тривимірної сіткою полімеру, яка непроникна для великих молекул, частково проникна для молекул проміжного розміру і добре проникна для невеликих молекул, солей і води. Залежно від середнього розміру осередку полімерного гелю і геометрії молекули останньої доступна більша або менша частина загального обсягу гранул гелю.
При русі розчину, що містить білки та інші молекули, по колонці, яка заповнена набряклими гранулами гелю, компоненти суміші, які проникли в гель, затримуються в ньому. Таким чином, вони відстають від більш великих молекул, які не можуть увійти всередину гранул і знаходяться тільки в омиває їх розчині. Не будучи включеними в гель, великі молекули з'являються в елюаті, як тільки через колонку пройде "вільний" обсяг розчину, що дорівнює об'єму розчину, укладеним між гранулами гелю. Останній визначається щільністю упаковки і геометрією гранул. Сферичний, у вигляді яких зазвичай і випускаються матеріали для гель-хроматографії, вільний обсяг становить 30-35% загального обсягу колонки.
Якщо розміри молекул білка такі, що вони можуть проникати в пори, складові певну частину обсягу гранул, то буде спостерігатися затримка елюціі і білок з'явиться в обсязі Ve, пов'язаному з коефіцієнтом доступності (процентним відношенням обсягів гранул, доступною даному виду молекул) співвідношенням:
де V, - повний обсяг колонки, за вирахуванням тієї його частини, яка припадає на сам гель утворює полімер.
Кожному білку в залежності від розмірів його молекули відповідає своє значення, на чому і заснувало поділ при гель-хроматографії. Зрозуміло, що якщо обсяг елюціі близький до вільного об'єму, то прагне до нуля і поділу білків, молекули яких практично не входять в пори гелю, не відбудеться. Точно так же молекули невеликих розмірів, для яких проникний весь обсяг гелю (Ve близький до і прагне до одиниці), в гелі з даними характеристиками розділяться. Найкраще дозвіл виходить, якщо знаходиться в межах 0,4 - 0,6. Зрозуміло, межі поділу можна розширити, використовуючи для високомолекулярних білків великопористі, а для невеликих - дрібнопористі гелі.
Строго кажучи, при гель-хроматографії поділ білків визначається не молекулярної масою, а геометричними розмірами молекули. Відповідно, молекули витягнутої форми за рахунок "перекидання" в розчині важче проникають в гелі, ніж сферичні молекули такий же молекулярної маси. Цим пояснюється рання елюція денатурованих білків, які ведуть себе як невпорядкований пухкий клубок, а не як компактна кулька.
Проста залежність між обсягом елюціі і молекулярною масою білка (справедлива, звичайно, тільки для компактних сферичних молекул) і легкість експерименту зробили гель-хроматографію улюбленим методом визначення молекулярної маси білків. Для цієї мети колонку, заповнену відповідним гелем, калібрують набором білків з відомими молекулярними масами, після чого визначають обсяг елюціі досліджуваного білка і обчислюють його молекулярну масу інтерполяцією. Точність методу не дуже велика, але цілком достатня для більшості практично можна зустріти завдань.
При використанні даного методу необхідно враховувати обмеження, що виникають із-за того, що гель, який утворює матеріал не цілком інертний, як це передбачає теорія методу, і може взаємодіяти з речовинами, що, що спотворює залежність обсягу елюціі від розміру молекули. Це особливо позначається при поділі малих кількостей білка, так як сорбційна ємність матриці гелю невелика і в великомасштабних дослідах її взаємодія з білком мало відбивається на процесі.
Зв'язування білків гельобразующімі матеріалами може бути викликано іонообмінними взаємодіями, зокрема вмістом негативно заряджених груп в полісахаридних матрицях (сефароза, сефадексе), а також в поліакриламідних матеріалах. В останніх карбоксильні групи виникають при спонтанному гідролізі амідів, в полисахаридах ж вони можуть утворюватися в результаті окислення. Затримка при гель-хроматографії, викликана іонообмінними взаємодіями з матрицею, особливо характерна для катіонних білків, наприклад лізоциму і деяких субтилизина. Нерідко вона дуже значна і може навіть перешкоджати відділенню солей від білка. В аналітичних дослідах таке утримування вдається придушити значним підвищенням іонної сили розчину.
Ще одна причина аномального утримування речовин при гель-хроматографії, особливо помітна при виділенні невеликих молекул, наприклад пептидів. - Гидрофобное зв'язування з матрицею гелю.
Гідрофобні елементи включаються в гідрофільні полісахаридні матриці при обробці їх зшиваючими агентами, зокрема епі-хлоргидрина, при синтезі сефадексе. Пептиди, що містять гідрофобні, особливо ароматичні, залишки (фенілалаііна, триптофану) іноді утримуються матрицею настільки значно, що з'являються в елюаті пізніше неорганічних солей.
Роздільна здатність методу не дуже велика, в той же час простота проведення і м'якість умов експерименту є його безперечними перевагами. Застосування методу на перших етапах очистки обмежується тим, що для задовільного фракціонування білків обсяг наноситься розчину не повинен перевищувати
3-5% загального обсягу колонки. Зважаючи на це до гель-хроматографії зазвичай вдаються в середині або на завершальних етапах виділення білка. Зрозуміло, при відділенні низькомолекулярних домішок, зокрема при обессоливании, обсяг зразка може бути значно більшим, оскільки не потрібно високої роздільної здатності. В такому спрощеному варіанті гель-фільтрацію використовують особливо часто.
Незважаючи на зазначені обмеження, гель-хроматографія - зручний спосіб фракціонування білків. Його застосовують і для відділення від білків низькомолекулярних домішок, в тому числі солей.
Останнім часом поряд з гельобразующімі матеріалами для розділення білків за розмірами почали застосовувати макропористі неорганічні носії - макропористі скло і силікагель. Зазвичай поверхню цих матеріалів покривають гідрофільними органічними речовинами, щоб виключити необоротну сорбцію білків. Жорсткість цих матеріалів дозволяє розділяти білки за розміром молекул при підвищеному тиску, що прискорює процес і знижує перешкоди з боку дифузії.
Ионообменная хроматографія білків
Метод іонообмінної хроматографії, заснований на відмінностях в співвідношенні і розподілі заряджених груп на поверхні білка, належить до числа найбільш використовуваних. У хроматографії білків практично не застосовують синтетичні іонообмінні смоли на основі полістиролу, вельми популярні в аналітичній хімії амінокислот і пептидів. Це пояснюється, по-перше, великим вмістом поперечних зшивок, які роблять матеріали такого роду практично непроникними для білків, по-друге, сорбцией білків, часом необоротною, на гідрофобною поверхні полістиролу.
За вказаними міркувань для поділу білків використовують ионообменники, в яких матриця ( "підкладка") чітко гідрофільна. Особливо поширені ионообменники, одержувані приєднанням монотонних груп до целюлози, поперечно-зшитих декстранами (сефадексе).
Для отримання катіонів як ионогенной найчастіше використовують карбоксильну групу рКа якої, кілька змінюється в залежності від мікрооточення, близький до 4 (карбоксиметил (СМ) -проізводние целюлози, сефадексе, що містять угруповання
Карбоксильні групи таких іонітів негативно заряджені при рН 5 і вище і, отже, здатні зв'язувати білки, які в цих умовах несуть позитивний заряд. Зв'язування білків посилюється, якщо на їх поверхні зустрічаються скупчення ( "грона") катіонних груп. За інших рівних умов з катионитом краще зв'язуються білки більшою молекулярної маси, що пояснюється кооперативністю многоточечного взаємодії великих ділянок поверхні такого білка з аніонними групами іонообмінника.
Десорбція білків, пов'язаних катионитом, зазвичай досягається підвищенням іонної сили елюіруются розчину, причому взаємодіючі між собою заряджені групи білка і ионита виявляються в оточенні протилежно заряджених іонів солей. В результаті при певній концентрації солі, характерною для кожного білка, електростатичні взаємодії між ним і іонітом знімаються і білок елюіруются з колонки. Плавне збільшення іонної сили розчину, застосування лінійного або більш складного градієнта концентрації солі викликає десорбції спочатку найбільш слабо утримуваних молекул, потім більш міцно пов'язаних білків і т.д. У препаративних дослідах нерідко вдаються до ступінчастою елюції, при якій концентрації солі підвищується стрибками. Це прискорює поділ і дозволяє зібрати білок в невеликому обсязі, проте легко призводить до утворення одним і тим же білком кількох помилкових.
